БИОАКТИВНОСТЬ НАТИВНЫХ ФЛАВОНОИДОВ НА ПРИМЕРЕ КВЕРЦЕТИНА И ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА

 

 

Ежегодно химики синтезируют, выделяют и полностью характеризуют более 200000 новых индивидуальных веществ. Большая часть этих веществ, проходит первичные испытания на выявление той или иной биологической активности. Этот этап поиска и создания средств химической защиты растений и животных называют биологическим скринингом. Скрининг проводят в биологических лабораториях в стандартных условиях на живых клетках, микроорганизмах (in vitro), на семенах и зеленых растениях, на животных (in vivo): на насекомых, жуках, тараканах, мышах, крысах и т.д. Напряженность отбора на каждом этапе биотестирования очень высока – из сотен веществ отбираются лишь несколько наиболее активных препаратов, которые затем передаются на углубленные испытания. Cкрининг может включать несколько этапов отбора. На стадии первичного отбора биологи изучают действие химических веществ на жизнедеятельность клеток некоторых высших растений. Вещества, показавшие на этом этапе высокую активность, затем исследуются с целью определения характера их действия – стимулирования или ингибирования роста растений. Уровень биоактивности вещества оценивается в сравнении с действием контрольного образца. Считается необходимым, чтобы все новые синтезируемые вещества были подвергнуты первичным испытаниям.

Целью нашей работы является определение биологической активности флавоноидов и их производных. В качестве исследуемых веществ были выбраны дигидрокверцетин (ДКВ) (оптически активный рацемат), кверцетин (КВ). В качестве тест-объектов – семена злаковых культур: гречихи, ржи, овса и пшеницы.

Дигидрокверцетин (2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-[3’,4’-дигидроксифенил]-4Н-1-бензопиран-4-он (таксифолин) относится к антиоксидантам натурального происхождения, или биофлавоноидам, был выделен из древесины лиственницы методом жидкофазной экстракции [1]. Кверцетин (2-(3,4-дигидроксифенил)-3,5,7-тригидрокси-4Н-хромен-4-он-(3,5,7,3′,4′–пентагидроксифлавон), был получен из древесины лиственницы [2].

Полученные вещества были исследованы на биологическую активность при помощи метода биотестирования.

Биотестирование – это метод анализа, заключающийся в определении действия токсикантов на специально выбранные организмы в стандартных условиях с регистрацией различных поведенческих, физиологических или биохимических показателей. Биотестирование дает возможность быстрого получения интегральной оценки токсичности, что делает весьма привлекательным его применение при скрининговых исследованиях.

В качестве тест-объектов в нашем исследовании были использованы семена злаковых культур: овса, ржи, пшеницы и гречихи.

Фоновым раствором для биотестирования был выбран диметилсульфоксид (ДМСО). Благодаря своей сильной растворяющей способности, диметилсульфоксид часто используют как растворитель в химических реакциях. Диметилсульфоксид используется в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для ингибирования спаривания исходных молекул ДНК. Также диметилсульфоксид используется как криопротектор. Он добавляется в клеточную среду для предотвращения повреждения клеток при их заморозке. В качестве лекарственного средства диметилсульфоксид применяется в виде водных растворов (10–15 %), как местное противовоспалительное и обезболивающее средство, а также в составе мазей – для увеличения трансдермального переноса действующих веществ, поскольку за несколько секунд проникает через кожу и переносит другие вещества.

В ходе эксперимента установлено, что ДМСО увеличивает время прорастания семян тест-объектов, не влияя на всхожесть, которая остается на уровне стандарта (рис. 1).

 

Рис. 1. Время прорастания семян тест-объектов в 1 %-ом и 4 %-ом водных растворах ДМСО:
1–3 – овес, 5–7 – рожь, 9–11 – пшеница, 13–15 – гречиха

 

Также было установлено, что ингибирующее влияние ДМСО напрямую зависит от его концентрации. Выявлено, что 1 %-е и 4 %-е растворы ДМСО оптимальны для наиболее точного наблюдения за ростом и развитием семян выбранных растений.

Биотестирование исследуемых веществ показало их различную биологическую активность и биоселективность выбранных представителей флавоноидов.

Так, в ходе исследований было выяснено, что растворы КВ уменьшили время прорастания семян, оказав наибольшее влияние на семена гречихи, уменьшив его почти в 1,5 раза по сравнению со стандартом (рис. 2).

 

Рис. 2. Время прорастания семян выбранных растений в 10 %-х и 20 %-х растворах КВ в 1 %-ом растворе ДМСО: 1–3 – овес, 5–7 – рожь, 9–11 –  пшеница, 13–15 – гречиха

 

Также установлено, что на развитие корневой системы семени гречихи КВ тоже оказывает стимулирующее действие.

Как видно на представленной фотографии на рисунке 3, длина корня гречихи увеличивается с увеличением концентрации КВ в растворе.

 

Рис. 3. Длина корней гречихи через 24 часа после прорастания в растворах КВ

 

С другой стороны, КВ замедлил развитие остальных семян (рис. 4). Особенно хорошо это видно на примере ржи, длина корня которой меньше, чем в стандартном растворе почти в 1,6 раза.

 

Рис. 4. Развитие корня семян растений в 10 %-х и 20 %-х растворах КВ в 1 %-ом растворе ДМСО:
L – средняя длина корня семян тест-объектов, 1–3 – овес, 5–7 – рожь, 9–11 – пшеница,
13–15 – гречиха

 

Растворы ДКВ ингибируют развитие и рост семян всех тест-объектов. Наиболее сильно это заметно на примере семян пшеницы, время прорастания которых в 10 %-ном растворе увеличилось в 1,7 раз по сравнению со стандартом (рис. 5).

 

Рис. 5. Время прорастания семян выбранных растений в 10 %-х и 20 %-х растворах дигидрокверцетина в 1 %-ом растворе ДМСО: 1–3 – овес, 5–7 – рожь, 9–11 – пшеница, 13–15 – гречиха

 

Также в ходе исследований выяснилось, что растворы ДКВ сильно задерживают развитие корневой системы и проростков семян всех тест-объектов (рис. 6).

 

Рис. 6. Развитие проростка семян выбранных растений в 10 %-х и 20 %-х растворах ДКВ в 1 %-ном растворе ДМСО: L – средняя длина проростка семян тест-объектов, 1–3 – овес, 5–7 – рожь,
9–11 – пшеница, 13–15  – гречиха

 

Длина корня ржи в 10 % растворе ДКВ в 2 раза меньше, чем стандартном 1 % растворе ДМСО. Длина проростков выбранных тест-объектов в растворах ДКВ также значительно меньше, чем в стандартном растворе (рис. 7). Возможно, это связано с тем, что раствор ДКВ уплотняет мембраны клеток и тем самым тормозит развитие семени. В ходе исследований также было выяснено, что действие дигидрокверцетина на семена тест-объектов не зависит от его концентрации.

 

Рис. 7. Развитие семян пшеницы в растворах ДКВ в 1 %-м растворе ДМСО через 24 часа после прорастания

 

На рисунке 8 заметно существенное отличие действия различных флавоноидов на культуру.

 

Рис. 8. Развитие семян пшеницы в растворах флавоноидов в 4 %-м растворе ДМСО через 24 часа после прорастания

 

Так, в растворе КВ, развитие корневой системы проходит интенсивнее, а длина проростка существенно меньше, чем в стандартном растворе ДМСО. С другой стороны, семечко, помещенное в раствор ДКВ, не развивается совсем (рис. 8).

В таблицах 1 и 2 влияния растворов флавоноидов в 1 %-ном растворе ДМСО на семена ржи и гречихи хорошо видна селективность выбранных представителей флавоноидов.

 

Таблица 1.

Влияние растворов флавоноидов в 1 %-м растворе ДМСО на семена ржи

Растворы Параметры	ДМСО 1 %	КВ 10 %	КВ 20 %	ДКВ 10 %	ДКВ 20 %
Время прорастания семян, t1	23	21	21	24	26
Время появления второго корня, t2	39	38	38	40	40
Время появления проростка, t3	44	43	43	45	48
Развитие корневой системы, l1	2,3	1,3	2	1	1,7
Развитие проростка, l2	1,5	0,5	0,3	0,3	0,1

t₁ – время появления первого корня у семени, час; t₃ – время появления проростка у семени, час; l₁ – средняя длина корня через 24 часа после прорастания, см; l₂ – средняя длина проростка через 24 часа после прорастания, см.

 

Так, время появления проростка у семян ржи в растворах флавоноидов практически совпадает со временем его появления у стандартного раствора, а у семян гречихи, оно существенно меньше. С другой стороны, развитие корневой системы и проростка гречихи остается на уровне стандарта, а у ржи оно в 1,5–2 раза меньше, чем в стандартном растворе ДМСО. Это свидетельствует о существенных различиях влияния флавоноидов на разные тест-объекты, т.е. об их селективности.

 

Таблица 2.

Влияние растворов флавоноидов в 1 %-м растворе ДМСО на семена гречихи

Растворы Параметры	ДМСО 1 %	КВ 10 %	КВ 20 %	ДКВ 10 %	ДКВ 20 %
Время прорастания семян, t1	29	26	21	36	38
Время появления проростка, t3	68	46	46	49	49
Развитие корневой системы, l1	2,2	2,8	3,5	1,4	1,4
Развитие проростка, l2	0,6	0,5	0,5	—	—

t₁ – время появления первого корня у семени, час; t₃ – время появления проростка у семени, час; l₁ – средняя длина корня через 24 часа после прорастания, см; l₂ – средняя длина проростка через 24 часа после прорастания, см.

 

Таким образом, работа по изучению влияния химических препаратов на биологические объекты трудоемка и имеет экономические ограничения. Для интегральной оценки физиологической активности вновь получаемых веществ в химических лабораториях предлагается обратить большее внимание на экспресс-методы биотестирования, в частности, с использованием семян агрокультур.

Установлено, что оптимальными для проведения биотестирования являются водные растворы апротонного диметилсульфоксида, являющегося растворителем большинства органических веществ.

Биотестированием флавоноидов с использованием семян агрокультур показана ярко выраженная биоселективность соединений. Так, растворы кверцетина оказывают положительное влияние на развитие корневой системы гречихи, но значительно ингибируют развитие семян ржи. В отличие от кверцетина родственный ему дигидрокверцетин тормозит развитие тест-агрокультур.

  

 

Список использованных источников 

 

1. Способ комплексной переработки древесины лиственницы : пат. 2361871 Рос. Федерация / Нифантьев Э. Е., Телешев А. Т., Коротеев М. П., Казиев Г. З.; заявл. 28.12.2007; опубл. 20.07.2009. Бюл. № 20. 7 с.
2. Структурные особенности 3,5,7,3′,4′–пентагидроксифлавона, полученного из древесины лиственницы / Е. Н. Мишина, А. С. Головешкин, И. С. Бушмаринов, А. Т. Телешев, В. Ю. Мишина, Э. Е. Нифантьев // Химия растительного сырья. 2012. № 4. C. 85–90.

 

---

 

Abrashina Irina

PhD in Chemistry, associate Professor, Department Biological and Pharmaceutical Chemistry, Pharmacy Organization and Management, State Budgetary Educational Institution of Higher Education «National Research Ogarev Mordovia State University», Saransk

 

Zotova Lyudmila

PhD in Biology, associate Professor, Department Biological and Pharmaceutical Chemistry, Pharmacy Organization and Management, State Budgetary Educational Institution of Higher Education «National Research Ogarev Mordovia State University», Saransk

 

Kovalenko Elena

PhD in Biology, associate Professor, Department Biological and Pharmaceutical Chemistry, Pharmacy Organization and Management, State Budgetary Educational Institution of Higher Education «National Research Ogarev Mordovia State University», Saransk

 

BIOACTIVITY OF NATIVE FLAVONOIDS ON THE EXAMPLE OF QUERCETIN AND DIHYDROQUERCETIN

 

This article discusses the results of the study of the biological activity of flavonoids on the example of quercetin and dihydroquercetin. Biotesting of flavonoids with the use of seeds of crop species showed a clearly expressed compounds selectivity.

 

Keywords: biological activity, flavonoids, quercetin, dihydroquercetin, biotesting, bioselectivity.

 

© АНО СНОЛД «Партнёр», 2019

© Абрашина И. В., 2019

© Зотова Л. В., 2019

© Коваленко Е. Н., 2019